大肠癌噬菌体抗体库的构建及抗CEA抗体的筛选最好的在线医师网站
摘要目的构建及初步鉴定大肠癌噬菌体抗体Fab呈现库，筛选人CEA单克隆抗体，并进行序列分析。方法分离大肠癌患者外周血淋巴细胞，提取淋巴细胞总RNA，逆转录成cDNA。用PCR扩增人全套抗体基因片段，克隆于pComb3载体，再经电穿孔转化大肠杆菌XL1Blue菌株，形成噬菌体抗体库。以固相化CEA抗原淘筛抗体库，ELISA鉴定噬菌体抗体。其中一个阳性克隆进行测序。结果逆转录PCR分别扩增出约680bp大小的κ、λ和Fd基因。PCR产物和载体经纯化、双酶切后进行连接转化，成功地构建了人源性Fab抗体基因库，库容量达2。1×107，Fab基因重组率为50%。以单抗捕捉的CEA抗原淘洗4轮，出现特异性富集，阳性克隆经直接ELISA和交叉反应ELISA实验证实具有良好的抗CEA抗原特异性。DNA测序表明该抗体重链属IgG亚类并含有一条IgL亚类的轻链。结论成功构建了大肠癌患者自然致敏抗体Fab段噬菌体呈现库，从中获得可与CEA抗原结合的噬菌体抗体，由此为大肠癌早期诊断及基因治疗提供了一种新的思路和方法。
关键词大肠肿瘤；噬菌体抗体库；Fab抗体；癌胚抗原
Abstract：ObjectiveToconstructtheFabphagedisplayantibodylibraryofcolorectalcancersoastoscreencarcinoembryonicantigen（CEA）phageantibodyfromtheconstructedphagedisplaylibrary。MethodsThetotalcellRNAwasextractedfromacolorectalcancerpatient‘speripherallymphocytes，andreversetranscribedintocDNA。ThesecDNAwereamplifiedtothelightandtheheavychainDNAbyPCRusingrelevantprimers，andthenclonedintotheexpressionpComb3vector。ThroughtransformedintoXL1BlueEscherichiacolibyelectroporation，thephagedisplayantibodylibrarywasconstructedsuccessively。Afterthat，CEAantigenwascoatedtopantheconstructedlibraryinordertoselectantigenbinders，andtheselectedphageantibodieswereassayedbyELISAanalysis。OnepositiveclonewasanalyzedbyDNAsequenced。ResultsTheamplifiedfragmentsofκ，λandFdDNAwereabout680bp。TheamplificationproductswereclonedintotheexpressionpComb3vectorandwereexpressedinXL1BlueEscherichiacoli。AhumanFabantibodylibrarywasconstructedwithasizeof2。1×107andanefficacyofabout50%（κ，λandFdDNAwereallinserted）。UsingcoatedCEAantigentopanthephagedisplayantibodylibraryfourrounds，thephageantibodiesshowedenrichmentspecifically。ThepositivecloneshadgoodantiCEAspecificitywhichverifiedbyELISAdirectlyandcrossreaction。ThroughDNAsequencingofonepositiveclone，itshowedthatitsheavychainbelongedtoIgGsubvarietyanditslightchaintoIgLsubvariety。ConclusionWesucceedinconstructingaFabphagedisplayantibodieslibrarywithnaturalimmunitybyacolorectalcancerpatient。Fromit，wealsosucceedinobtainingtheantibodywhichhasthebindingactivitytoCEAantigen。
Keywords：colorectalcancer;phageantibodylibrary;Fabantibody;carcinoembryonicantigen
噬菌体抗体库技术将抗体轻链基因和重链基因在体外重组并借助噬菌体表面展示（phagedisplay）系统对目的抗体基因进行筛选[1]。该技术能够绕开细胞杂交瘤技术，直接从基因水平制备特异性单链抗体，由此开创了简便、快速生产基因工程抗体的先河，这被认为是继杂交瘤技术后抗体生产技术的又一次革命。自该技术的问世，已被广泛用于生物医学的许多领域。我们采用噬菌体显示技术构建了人大肠癌自然致敏抗体Fab段噬菌体呈现库，以人CEA作为目标抗原，制备了人源性的抗CEA单克隆抗体。
1材料和方法
1。1材料
1。1。1噬粒、菌株、细胞及主要试剂表达噬粒载体pComb3、大肠埃希菌菌株XL1Blue和辅助噬菌体VCSM13为本研究室保存。淋巴细胞分离液（天津血液研究所），总RNA提取试剂盒（invitrogen产品），逆转录试剂盒（Promega公司）、Taq酶及PCR缓冲液（TaKaRa公司产品），DNA凝胶纯化回收试剂盒（TaKaRa公司产品），各种限制性内切酶（Promega产品）。羊抗人IgG（Fab）HRP购自Pierce公司，邻苯二胺（OPD）购自博士德公司。LB、SB、SOC培养基配置参照文献[1]。
1。1。2PCR引物引物设计参见文献[2]。由上海生物工程有限公司合成。序列如下：
HumanvariableandconstantregionPCRprimersusedforphagelibraryconstruction
Humanchainvariableregion5’primers：
VH1a5’CAGGTGCAGCTCGAGCAGTCTGG3’
VH1f5’CAGGTGCAGCTGCTCGAGTCTGGG3’
VH2f5’CAGGTGCAGCTACTCGAGTCGGG3’
VH3a5’GAGGTGCAGCTCGAGGAGTCTGGG3’
VH3f5’GAGGTGCAGCTGCTCGAGTCTGGG3’
VH4f5’CAGGTGCAGCTGCTCGAGTCGGG3’
VH4gs5’CAGGTGCAGCTACTCGAGTGGGGC3’
VH6a5’CAGGTACAGCTCGAGCAGTCAGG3’
VH6f5’CAGGTACAGCTGCTCGAGTCAGGTCCA3’
Heavychainγ1constantregion3’primer：
CGlz5’GCATGTACTAGTTTTGTCACAAGATTTGGG3’
κlightchainvariableregion5’primes：
VK1a5’GACATCGAGCTCACCCAGTCTCCA3’
VK1s5’GACATCGAGCTCACCCAGTCTCC3’
VK2a5’GATATTGAGCTCACTCAGTCTCCA3’
VK3a5’GAAATTGAGCTCACGCAGTCTCCA3’
VK3b5’GAAATTGAGCTCACACAGTCTCCA3’
κlightchainconstantregion3’prime：
CK1d5’GCGCCGTCTAGAATTAACACTCTCCCCTGTGAAGCTCTTTGTGACGGGCGAACTCAG3’
λlightchainvariableregion5’primers：
VL15’AATTTTGAGCTCACTCAGCCCCAC3’
VL25’TCTGCCGAGCTCCAGCCTGCCTCCGTG3’
VL35’TCTGTGGAGCTCCAGCCGCCCTCAGTG3’
VL3’5’TCCTATGAGCTCACTCAGCCACCC3’
VL45’TCTGAAGAGCTCCAGGACCCTGTTGTGTCTGTG3’
VL55’CAGTCTGAGCTCACGCAGCCGCCC3’
VL65’CAGACTGAGCTCACTCAGGAGCCC3’
VL75’CAGGTTGAGCTCACTCAACCGCCC3’
VL85’CAGGCTGAGCTCACTCAGCCGTCTTCC3’
VL95’CAGTATGAGCTCACTCAGCCTCCC3’
VL1b/s5’CAGTCTGAGCTCACTCAGCCACC3’
λlightchainconstantregion3’primers：
CL25’CGCCGTCTAGAATTATGAACATTCTGTAGG3’
Underlinenucleotidesrepresentprimerencodedrestrictionsits。
CTCGAG内切酶XhoI识别位点；ACTAGT内切酶SpeI识别位点；GAGCTC内切酶SacI识别位点；TCTAGA内切酶XbaI识别位点。
1。2方法
1。2。1标本制备、总RNA提取和cDNA的合成抽取大肠癌患者的外周血20ml，用淋巴细胞分离液常规分离PBMC，然后按试剂盒说明进行总RNA的提取，检测其完整性和纯度。
1。2。2逆转录PCR反应采用逆转录试剂盒。反应体积为25μl，取淋巴细胞总RNA4μg，加入0。5μgOligo（dt），40URNA酶抑制剂，250μmol/LdNTPs，40UAMV逆转录酶。于42℃60min，95℃5min，合成单链cDNA。然后进行PCR反应，反应体积各为100μl。取上述合成的单链cDNA2μl分别加入与κ、λ轻链和重链Fd段分别配对的引物各50pmol/L，dNTPs200μmol/L，10×Taq酶缓冲液10μl，Taq酶5U。循环参数为93℃45s，52℃60s，72℃90s，共35个循环。PCR产物各行1%琼脂糖凝胶电泳分离后纯化回收。
1。2。3轻链表达载体的构建纯化的κ、λ轻链PCR产物与pComb3分别以适量XbaI及SacI双酶切后仍经1%琼脂糖凝胶电泳分离后纯化回收。回收的PCR产物等量混均后与线性pComb3连接，连接反应体系中线性pComb3与轻链PCR产物的mol比为1：3，T4DNA连接酶9U，总体积50μl，16℃反应15h。连接反应产物以PromegaDNA纯化试剂盒纯化。电穿孔（25kv，200Ω，25μF）转化大肠杆菌XL1Blue后置5mlSOC培养液中。37℃下振荡培养（250rpm）1h，加入预温的SB10ml（含20ml/LAmp和10mg/LTet），混匀后即取出10、1、0。1μl铺在LB平板（含50mg/LAmp及10mg/LTet）上，37℃过夜，测定转化率。余继续振荡培养1h后调Amp浓度至50mg/L，再振荡培养1h，并入100mlSB（含50mg/LAmp、10mg/LTet），37℃振荡培养（250rpm）。从过夜培育的细菌中提取质粒，即得带轻链插段的pComb3，即轻链表达载体。
1。2。4抗体Fab段表达载体的构建（噬菌体抗体呈现库的构建）及酶切鉴定将PCR扩增的重链Fd段基因和轻链重组质粒分别以XhoI/SpeI双酶切，按前法进行连接、转化、细菌扩增及转化子测定。但在加入100mlSB振荡3h后，加入1012pfu的辅助噬菌体VCSM13，再培养2h后，加卡那霉素至70mg/L，37℃振荡过夜。次晨4℃，4000×g离心15min，向上清中加入固体聚乙二醇（PEG8000）及NaCl，两者终浓度分别为40和30g/L，溶解后冰浴30min，4℃，9000×g离心20min弃上清，以2ml10g/L牛血清白蛋白Tris缓冲液（BSATBS）悬浮噬菌体沉淀，14000×g离心5min以除去残留细菌碎片。上清加叠氮钠（NaN3）至0。2g/L，即得Fab噬菌体呈现原始库。随机挑取10个单菌落，扩增后提取质粒，分别用XhoI/SpeI及SacI/XbaI进行双酶切，鉴定其重组率。
1。2。5噬菌体抗体的筛选（参照文献[3]）将CEA抗原用0。05mol/L的碳酸盐缓冲液（pH9。6）稀释至50mg/L，按每孔100μl包被酶联板，4℃过夜；然后用3%BSA封闭，37℃反应1h。加入100μl噬菌体抗体库（约1012cfu），37℃反应2h。用TBST（50mmol/LTrisHCl，pH7。5，150mmol/LNaCl，0。5%Tween20）洗涤10次，用蒸馏水冲洗1min。加入100μl洗脱液（0。1mol/LHCl，用甘氨酸调pH值至2。2，加入BSA至0。1%），吹打后室温静置10min。加入6μl2mol/L的Tris中和。然后将其转入2ml新鲜培养的XL1Blue（A600≈1）室温静置15min，取出10、1、0。1μl铺在LB平板（含50mg/LAmp及10mg/LTet）上，37℃过夜，测定转化率。余全部转入10mlSB培养基（含20ml/LAmp和10mg/LTet）中，37℃培养1h。然后转入100mlSB培养基（含50ml/LAmp和10mg/LTet）中继续培养2h，再加入100μl的辅助噬菌体VCSM13（约1012pfu），37℃培养2h。加入卡那霉素至70mg/L，37℃振荡培养过夜。次晨4℃，4000×g离心15min，收集上清，加入聚乙二醇（PEG8000）和NaCl分别至4%和3%，溶解后冰浴30min。4℃，9000×g离心20min弃上清，以2ml10g/L牛血清白蛋白Tris缓冲液（BSATBS）悬浮噬菌体沉淀，14000×g离心5min以除去残留细菌碎片，收集上清。重复此过程4次。
1。2。6噬菌体抗体的制备最后一次筛选获得的噬菌体转染新鲜的XL1Blue，铺于含100mg/L羧苄霉素、10mg/L四环素的LB平板。挑取10个抗性菌落分别接种于2mlSB培养基（含50mg/LAmp及10mg/LTet）中，37℃培养6h后（A600≈0。3），加入100μlVCSM13，2h后加入卡那霉素至70mg/L继续培养过夜。4000×g离心15min，取上清再离心一次，加BSA至1%，收集上清，用于ELISA检测。第1期大肠癌噬菌体抗体库的构建及抗CEA抗体的筛选南清振，等
1。2。7ELISA检测噬菌体抗体的抗原结合活性及交叉反应实验用CEA、Ca125抗原各0。5μg/孔包被酶标板，3%BSA封闭，将待测噬菌体抗体加入孔中，室温反应1h。用TBST洗涤3次后，加入羊抗人IgG（Fab）HRP（1：1000稀释），进行结合反应1h。用邻苯二胺显色，2mol/LH2SO4终止反应，测定A490nm值，初步鉴定出阳性克隆，同时观察其与Ca125抗原的反应情况。
1。2。8DNA测序及序列分析上述一个阳性克隆用PCR方法分别将轻链和重链扩增出来，切胶回收后将扩增的基因片段克隆入PBST载体中，按3730型测序仪说明书所述步骤进行操作。
1。3统计学方法应用SPSS13。0统计软件，t检验分析噬菌体抗体对CEA、Ca125抗原的结合活性，P<0。05为具有统计学意义。
2结果
2。1淋巴细胞的分离及总RNA的提取常规淋巴细胞分离后计数，20ml外周血共分离出2×107个淋巴细胞。淋巴细胞提取的总RNA，经碱变性琼脂糖凝胶电泳，可见RNA完整，纯度（A260/A280）为1。94。
2。2RTPCR扩增轻链和重链结果将上述提取的总RNA逆转录合成单链cDNA后作为模板，PCR扩增抗体Fab段κ、λ轻链和重链Fd段的基因。可见除VL7未扩出条带外，其余均可扩增出约680bp产物条带，与预期长度相符，从而获得到人抗体Fab段κ、λ轻链和重链Fd段的基因片段。（见图1）
图1RTPCR扩增轻链和重链可变区基因。从左到右：1、2000Markers；2、3κ轻链VK1a，VK3b；4、5、6、7λ轻链VL7，VL1，VL4，医生在线答疑，VL8；8、9重链Fd段VH1a，VH4gs。可见除λ轻链VL7外，余引物均可扩增出680bp大小的基因产物。（略）
2。3轻链表达载体的构建及插入效率测定将扩增出约680bp纯化后的κ、λ轻链PCR产物重组入pComb3，用纯化的连接产物转化感受态XL1Blue细胞，取15ml重组菌液中的10、1、0。1μl分别铺带有Amp和Tet抗性的LB培养板。结果以0。1μl转化细菌菌液所铺LB培养板上计数菌落有268个，则转化子数=15（ml）×1000×268/0。1（μl）=4。02×107。挑10个单菌落提取质粒，分别用SacI/XbaI进行双酶切，测定插入效率。可见其中8个质粒中有680bp的片段切出。即相应质粒中含有κ、λ轻链基因，重组效率为80%，实际轻链表达载体基因库的库容量为4。02×107×80%=3。216×107。
表1ELISA法检测噬菌体抗体对CEA、Ca125抗原的结合活性（略）
2。4抗体Fab段表达载体的构建（噬菌体抗体呈现库的构建）及插入效率测定将PCR扩增的重链Fd段基因重组入轻链重组质粒中的相应位点，得到抗体Fab段基因库。同上法，测定转化子数为2。1×107。挑10个单菌落提取质粒，分别用XhoI/SpeI及SacI/XbaI进行双酶切，鉴定其重组率。可见7个质粒有约680bp的重链Fd段基因片段切出；8个质粒中有约680bp的κ、λ轻链基因片段切出；5个质粒均可切出轻重链基因片段。（见图2）即实际抗体Fab段表达载体基因库中均有轻重链基因的容量为2。1×107×50%=1。05×107。
图2双酶切鉴定重组体。从左到右：1、2000markers；2、对照未酶切质粒；3、4、8用XhoI及SpeI双酶切各单重组质粒；5、6、7、9用XbaI及SacI双酶切各单重组质粒。可见3、4、5、6、7有680bp的片段切出，说明其为阳性重组体；8、9未见有基因片段切出，说明为阴性重组体。（略）
2。5噬菌体抗体的筛选将CEA作为固相抗原，经过4轮“吸附洗脱扩增”筛选，结果每1轮洗脱下来的噬菌体数量均较前1轮增加，第1轮为1。23×105，第4轮为1。02×106，增加了近10倍（P<0。01），说明携带抗CEA抗体的特异性噬菌体得到了明显富集。
2。6ELISA检测噬菌体抗体的抗原结合活性及交叉反应实验从第4轮淘筛后的铺平板菌落中，随机挑取10个克隆制备单克隆噬菌体抗体，ELISA法检测对CEA、Ca125抗原的结合活性。结果由表1（对照为没有Fab段的pComb3噬菌体）可见，所有克隆对于Ca125抗原均反应不明显（与对照比较P>0。05），对CEA抗原均有一定的活性（与对照比较P<0。01），其中第7号克隆的A490nm值为0。17，较其他克隆的值都高。表明这些抗体具有CEA抗原的特异结合活性。
2。7DNA测序及序列分析取上述第7号克隆进行测序，测序结果与GENEBANK等基因库已知DNA序列进行同源性比较，结果显示重链属于IgG类，轻链属于IgL类，序列同源性均在90%以上。具体DNA及翻译成氨基酸的序列如下：重链DNA序列为（测序图见图3）：
CTCGAGTCGGGCCCAGGGCTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCATTGTCTCTGGTGACTCCATCAGTAGTCACTACTGGAGCTGGCTCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGCAAATATGTATCACACTGGGAGCACCTACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATGTCAATAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGGAGCTGAGCTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATATTCGTGAAGTGGGAGCTACACTATACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTAGT重链DNA序列翻译成氨基酸，其序列为：
LESGPGLVKPSETLSLTCIVSGDSISSHYWSWLRQPPGKGLEWIANMYHTGSTYYNPSLKSRVTMSIDTSKNQFSLELSSVTAADTAVYYCARDIREVGATLYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTS
图3重链DNA序列测序图（略）
图4轻链DNA序列测序图（略）
轻链DNA序列（测序图见图4）：
CGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATCTGCCGAGCTCCAGCCTGCCTCCGTGTCCGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAACAGTGACGTTGGTCTTTATAACTTTGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCACACTCATAATTTATGGTGTCAGTAACCGGCCCTCAGGGGTTTCTGATCGCTTCTCCGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGAGTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTATTGTACCTCTCTTAGAAACGACAACACTTGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAACTGACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGTGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCTGACAGTGGAAGTCCCACAAAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAAATGTTCATA轻链DNA序列翻译成氨基酸，其序列为：
RGRRYRZAZSAELQPASVSGSPGQSITISCTGTNSDVGLYNFVSWYQQHPGKAPTLIIYGVSNRPSGVSDRFSGSKSGNTASLTISGVQAEDEADYYCTSLRNDNTWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKVGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPDSGSPTKATAARSRMKGSTVEKTVAPTEMFI
3讨论随着基因工程技术和抗体分子遗传学的深入研究，诞生出新型抗体—基因工程抗体，其中抗体库技术则是构建、表达基因工程抗体的研究热点[4]。建立在PCR技术和噬菌体表面呈现技术（phagedisplay）上的噬菌体抗体库（phageantibodylibrary）技术[5～7]，有效地解决了鼠源性抗体应用于人体后产生的人抗鼠抗体（HAMA）反应[8]。自90年代初噬菌体抗体库技术出现以来，使人们得以从应用DNA重组技术改造现有的单抗发展到利用基因工程技术克隆新的抗体分子，抗体工程进入了一个全新的时期，在感染性疾病的诊治、自身免疫性疾病与病毒性疾病的鉴别、肿瘤的影像分析和导向治疗或基因治疗，抗原表位分析以指导疫苗分子的设计、新型药物设计、蛋白分子免疫识别机制的研究等多个领域显示出巨大的潜能和广阔的应用前景[9～12]。我们经逆转录PCR，从大肠癌患者外周血淋巴细胞中扩增出抗体重链Fd及κ、λ轻链基因，其大小为680bp左右。以大肠癌患者外周血淋巴细胞为研究对象，理论上讲，经肿瘤抗原免疫，B细胞抗体中轻链基因已经特异拼接和重排，建立的人源性抗体库筛选抗体的目的性强。利用噬菌体抗体库技术制备人源性单抗，医生在线答疑，该方法较好的解决了人体杂交瘤低效的难题，制备的单抗有人源性，可以运用到人体内而少副反应。CEA是一个应用普遍的肿瘤标志物，其单抗已广泛应用于结直肠癌的早期诊断，复发的监测及导向治疗中[13]。本研究制备的CEA噬菌体抗体初步显示了对CEA抗原有一定的活性和特异性。其中一个阳性克隆经过测序发现其重链属于IgG类，轻链属于IgL类，序列同源性均在90%以上，进一步的研究仍然在进行中。相信在不久的将来利用该噬菌体抗体库技术能够筛选出高特异性、高亲和力的人源性大肠癌Fab抗体，并运用于临床诊治中。
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